胰蛋白酶活力的測定方法還有哪些

胰蛋白酶的水溶液在pH3時(shí)最穩(wěn)定，故用鹽酸液（0.001mol/L）配制，在pH7.6-8.8時(shí)酶活性最高，故酶解時(shí)以磷酸鹽緩沖液（pH7.6）進(jìn)行控制。至于為什么空白和實(shí)驗(yàn)組在253nm處都顯示over，那就不清楚了。胰蛋白酶專一性地作用于賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的羧基組成的肽鍵、酰胺鍵及酯鍵，其水解速率：酯鍵＞酰胺鍵＞肽鍵。采用專屬性較高的合成底物：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE），在胰蛋白酶的作用下，底物被水解成苯酰酯-L-精氨酸，在253nm處的吸收度隨酶促反應(yīng)時(shí)間遞增。

同位素標(biāo)記法的實(shí)驗(yàn)介紹

選定放射性標(biāo)記劑的比活度λqδ的值必須足夠大，以保證實(shí)驗(yàn)所需要的靈敏度，而又要盡可能地小，使得在該實(shí)驗(yàn)條件下輻射自分解可忽略。一般情形是根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)周期長短，來選擇具有合適的衰變方式，輻射類型和半衰期，且放射毒性低的放射性同位素。至今已確定的放射性核素包括天然的58種和人工制造的約1300種，其中大多數(shù)不常能用作放射性標(biāo)記劑。主要原因是制備困難、半衰期不合適及放射性不足以定量。在任何一種生產(chǎn)方法中，生產(chǎn)步驟很可能包含或多或少的化學(xué)處理，因而標(biāo)記實(shí)驗(yàn)人員需要了解某個(gè)核素及其周圍的那些元素的化學(xué)性質(zhì)，因?yàn)樗鼈冇锌赡艹蔀榇朔派湫酝凰氐碾s質(zhì)。

放射性同位素都衰變（經(jīng)過或不經(jīng)過中間狀態(tài)）到處于基態(tài)的子體核素，衰變時(shí)伴隨各種形式的能量輻射，如α、β-、β+、γ、X放射等。在選擇標(biāo)記劑時(shí)，標(biāo)記實(shí)驗(yàn)人員要仔細(xì)研究衰變綱圖，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和計(jì)數(shù)條件來決定那一種輻射，在衰變綱變內(nèi)，代表核能級(jí)的兩條水平線之間和距離表示能量差，↑或↓表示能級(jí)同伴隨原子序數(shù)增或減少的能量，↓表示從激發(fā)態(tài)至基態(tài)的同質(zhì)異能躍遷。一般要選擇最適宜的半衰期τ的放射性同位素，使τ足夠長，從而使衰變校正有意義或干脆不必作衰變校正，同時(shí)又要足夠短，能較安全地進(jìn)行標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，并使得放射性廢物容易處理，在實(shí)際工作中，使用的放射性同位素的半衰期應(yīng)該與實(shí)驗(yàn)需要持續(xù)的時(shí)間t相適應(yīng)，如對(duì)于某個(gè)實(shí)驗(yàn)，t/τ=0.04時(shí)，應(yīng)所選放射性同位素的衰變校正為3.5%；而t/τ=0.10時(shí)，應(yīng)選放射性同位素的衰變校正為6.6%。t/τ=0.15時(shí)，應(yīng)選用其衰變校正為10%。

在體外標(biāo)記條件，一般選用半衰期較長而射線強(qiáng)度適中，既利于探測，又易于防護(hù)和保存的放射性標(biāo)記劑。體內(nèi)標(biāo)記條件下，若實(shí)驗(yàn)周期短，應(yīng)選用半衰期短，且能放出一定強(qiáng)度r射線物放射性同位素，若實(shí)驗(yàn)周期長，如需要將動(dòng)物活殺后對(duì)組織臟器分別測定的，則應(yīng)選用半衰期較長放射性同位素。此外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩磉x用定位的或不定位的標(biāo)記標(biāo)記劑，例如研究氨基酸的脫羧反應(yīng)，14C應(yīng)標(biāo)記在羧基上，只有這種定位標(biāo)記的氨基酸，才能在脫羧后產(chǎn)生14CO2。而有些實(shí)驗(yàn)不要求特定位置標(biāo)記，只須均勻標(biāo)記即可。

選擇放射性標(biāo)記劑還必須同時(shí)滿足高化學(xué)純度，高放射性核純度的要求。在標(biāo)記劑制備期間、貯存期間以用試驗(yàn)體系中所使用的溶劑、化學(xué)試劑、酶等可能會(huì)產(chǎn)生化學(xué)雜質(zhì)、放射化學(xué)雜質(zhì)及輻射自分解引起的放射性雜質(zhì)，這些雜質(zhì)的存在，使得標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中使用的標(biāo)記劑不“純”，而或多或少影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，甚至?xí)?dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)論。 氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）和尿嘧啶核苷（3H－UR）是兩種常用的標(biāo)記劑，前者有效地結(jié)合到DNA中，后者則摻入到RNA中，它們的輻射分解速度隨比較放射性的增高及保存時(shí)間的延長而增加，在不同溫度和不同溶液中的穩(wěn)定性也不同。

經(jīng)保存八年的3H-TdR約有35%輻射分解為3H－胸腺嘧啶，并導(dǎo)致二醇和水合物的形式，在實(shí)驗(yàn)中這雜質(zhì)會(huì)很快摻入細(xì)胞并與大分子（很可能是蛋白質(zhì)）結(jié)合，而不是與DNA和RNA相結(jié)合，這些雜質(zhì)用DNA酶和RNA酶處理細(xì)胞都不除去。3H－TdR和3H－UR貯存在-20℃的冷凍溶液中輻射分離速度要比+2℃增加3－4倍，但低溫度（-140℃）對(duì)貯存也有利，在允許對(duì)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)人員在選擇保存放射性標(biāo)記劑時(shí)會(huì)有所啟發(fā)。 測量方法的選擇取決于射線種類，對(duì)于α射線通常可用硫化鋅晶體、電離室、核乳膠等方法探測；對(duì)能量高的β射線可用云母窗計(jì)數(shù)管、塑料閃爍晶體及核乳膠測定，對(duì)于能量低的β射線可用液體閃爍計(jì)數(shù)器測量：對(duì)于γ射線則用G-M計(jì)數(shù)管，碘化鈉（鉈）閃爍晶體探測。目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室主要采用晶體閃爍計(jì)數(shù)法和液體閃爍計(jì)數(shù)法兩種測量方式。

同一臺(tái)探測儀器對(duì)不同量的標(biāo)記劑具有不同的最佳工作條件，在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段要檢查探測器是否已調(diào)有所用標(biāo)記同位素的工作條件，否則需要用一定量的標(biāo)記劑作為放射源（或選用該同位素的標(biāo)準(zhǔn)源），把探測器的最佳工作條件調(diào)整好，并且要保證探測器性能處于穩(wěn)定可靠的狀態(tài)。

探測最佳工作條件的選擇方法：一種是測“坪曲線”，另一種是找最好的品質(zhì)因素。對(duì)于光電倍增管，在理論上不存在“坪”（plateau）。但隨著高壓的增加，在一定范圍內(nèi)，脈沖數(shù)變化較小，形成一段坡度較小的電壓脈沖曲線，通常也稱其為坪。測坪曲線的方法：固定放射源，根據(jù)其射線能量的大小，初選 一個(gè)廣大器增益（放大倍數(shù)）和甄別器閾值。不斷地改變高壓（由低到高，均勻增加伏度），每改變一次高壓，都測定一次本底和放射源的計(jì)數(shù)率，最后作出高壓本底計(jì)數(shù)率和高壓放射源計(jì)數(shù)曲線。

用同樣的方法，作另一個(gè)甄別閾值（放大倍數(shù)不變）下的高壓計(jì)數(shù)率曲線，這樣反復(fù)多作幾條曲線。必要時(shí)，還可固定甄別閾值，改變放大倍數(shù)，求出高壓計(jì)數(shù)率曲線。應(yīng)選擇“坪”比較平坦的曲線工作條件：甄別閾值和放大增益，作為正式測定時(shí)間的儀器工作條件，高壓值應(yīng)選擇在該“坪”中點(diǎn)偏向起始段一邊相應(yīng)的高壓值。品質(zhì)因素，又稱為優(yōu)值，是指在一定條件下，要達(dá)到合適的統(tǒng)計(jì)數(shù)目所需要的時(shí)間是儀器的計(jì)數(shù)效率E和本底計(jì)數(shù)Nb的函數(shù)： 品質(zhì)因素F=E2/Nb它是衡量一臺(tái)計(jì)數(shù)器性能的指標(biāo)，儀器的品質(zhì)因素F應(yīng)該越大越好，品質(zhì)因素F越大，表示測量效率E越高而本底Nb越小。

如果某放射性標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)源存在來源困難等問題的話，可以用相對(duì)品質(zhì)因素f來代替。 相品質(zhì)因素f=ns/nb 式中ns指某種放射性樣品的計(jì)數(shù)率。找最好品質(zhì)因素的方法與測坪曲線一樣，作出幾條高壓－F（或f）的關(guān)系曲線，在幾條曲線中選擇峰值最高的曲線。這根曲線的峰值所對(duì)應(yīng)的條件：高壓，甄別閾，放大倍數(shù)等，就是該儀器對(duì)被測同位素的最佳工作條件。最佳品質(zhì)因素不一定恰好落在“坪”上，有的在“坪”附近，有的卻在“坪”的下端。著眼于把同位素的整個(gè)能譜峰都計(jì)下來的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)者主張取“坪”所對(duì)應(yīng)的工作條件，而著眼于優(yōu)值者，主張取最佳品質(zhì)因素所對(duì)應(yīng)的工作條件，也有人折衷。如果某儀器本底很低，光電倍增管噪音很低和能譜分辯高，二者應(yīng)該相差不大。同一臺(tái)儀器的最佳工作條件，隨儀器的使用期延長而有所改變，不同的放射性同位素，其最佳工作條件不同。因此核探測儀器的最佳工作條件具有專屬性，并且要經(jīng)常通過選擇其不同時(shí)期的最佳工作條件。更不能不問被測同位素的種類，而千篇一律地使用同一個(gè)工作條件。

為了達(dá)到準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)，可以長時(shí)間一次計(jì)數(shù)，或短時(shí)間多次測量，兩者達(dá)到的標(biāo)準(zhǔn)誤基本相同，為避免外界因素的影響，在實(shí)際工作中，取短時(shí)間多次測量較為合理適用。在測量樣品的放射性時(shí)，本底是一個(gè)重要影響因素。本底高，則標(biāo)準(zhǔn)誤和標(biāo)準(zhǔn)誤差都增大，尤其在樣品計(jì)數(shù)較低時(shí)，本底對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤和標(biāo)準(zhǔn)誤差的影響就愈大，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精度，而且為了達(dá)到一定的精度，勢別要增加樣品的測量時(shí)間。根據(jù)核衰變的統(tǒng)計(jì)規(guī)律，在實(shí)驗(yàn)中如果樣品數(shù)量少，選擇tN=1.4tb的比例（式中tN為樣品放射性測量時(shí)間，tb為本底測量時(shí)間）較為合理；如果樣品數(shù)量較多是一大批樣品，則延長本底測量時(shí)間tb，取tb的時(shí)間均值，而tN則可相對(duì)短，這樣可節(jié)省時(shí)間，有利于縮短實(shí)驗(yàn)周期。對(duì)于標(biāo)記實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來說，樣品中所含放射性強(qiáng)度的要求，是使其放射性計(jì)數(shù)率大于或等于本底計(jì)數(shù)的10－20倍。